等電聚焦電泳色譜儀是利用蛋白質(zhì)分子或其它兩性分子的等電點(diǎn)不同，在一個(gè)穩(wěn)定、連續(xù)和線性的pH梯度中進(jìn)行分離。按pH梯度的形成原理不同可分為載體兩性電解質(zhì)pH梯度等電聚焦電泳和固相pH梯度等電聚焦電泳。

一、載體兩性電解質(zhì)pH梯度等電聚焦電泳：

1、理想的載體兩性電解質(zhì)應(yīng)具備的條件：

載體兩性電解質(zhì)是兩性分子，使其在電泳柱中能達(dá)到一個(gè)平衡位置。載體兩性電解質(zhì)可作為載體，但兩性電解質(zhì)不能用于等電聚焦。只有載體兩性電解質(zhì)，即具有好的導(dǎo)電和緩沖能力的化合物才能用于等電聚焦。

（1）易溶于水，在pI處應(yīng)有足夠的緩沖能力，形成穩(wěn)定的pH梯度，不致被蛋白質(zhì)或其它兩性電解質(zhì)改變pH梯度。

（2）在pI處應(yīng)有良好的電導(dǎo)和相同的電導(dǎo)系數(shù)，以保持均勻的電場。

（3）分子量小，易與被分離物分開。

（4）化學(xué)性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學(xué)反應(yīng)，也無變性作用，其化學(xué)組成不同于蛋白質(zhì)。

2、蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）：

蛋白質(zhì)最主要的特性是它的帶電行為，在不同的pH環(huán)境中帶不同數(shù)量的正電或負(fù)電，只是在某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)的凈電荷為零，此pH即為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)取決于它的氨基酸組成和構(gòu)象，是一個(gè)物理化學(xué)常數(shù)。

3、載體兩性電解質(zhì)pH梯度的載體：

常用載體是聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠和葡聚糖凝膠等，其中聚丙烯酰胺凝膠最為常用。

4、載體兩性電解質(zhì)pH梯度的介質(zhì)：

一般采用氨基酸和氨基聚合羧酸的緩沖液。

5、載體兩性電解質(zhì)pH梯度的形成：

等電聚焦電泳的關(guān)鍵是pH梯度的形成，載體兩性電解質(zhì)pH梯度的介質(zhì)是兩性分子，在電場中遷移到自己的等電點(diǎn)后自然形成pH梯度。

在沒有電場時(shí)，載體兩性電解質(zhì)的pH值約是該溶液pH范圍的平均值，所有載體兩性電解質(zhì)分子都荷電。

當(dāng)引入電場時(shí)，載體兩性電解質(zhì)分子將向陰極或陽極遷移，帶有最低等電點(diǎn)的分子（荷負(fù)電最多）將最快地向陽極移動(dòng)，當(dāng)它達(dá)到凈電荷為零的位置時(shí)才停止，這個(gè)位置靠近陽極，由于它具有高的緩沖能力，使環(huán)境溶液的pH等于分子本身的pI。一些低pI的載體兩性電解質(zhì)（荷負(fù)電次多）也向陽極移動(dòng)，直到它的凈電荷減少到零時(shí)才停止。同樣，其周圍環(huán)境溶液pH值也等于它本身的pI。依次類推，所有的載體兩性電解質(zhì)分子用增加pI級(jí)數(shù)的方法將分別在陽極和陰極之間到達(dá)自己的位置，從而形成pH梯度。

6、工作原理：

蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)取決于其氨基酸的組成。組成每一種蛋白質(zhì)、多肽的氨基酸的數(shù)目和比例不同，蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)范圍很寬。在電泳儀中加入載體兩性電解質(zhì)，通直流電時(shí)，載體兩性電解質(zhì)即形成一個(gè)由陽極到陰極逐步升高的pH梯度。蛋白質(zhì)進(jìn)入時(shí)，不同的蛋白質(zhì)移動(dòng)到與其等電點(diǎn)相當(dāng)?shù)膒H位置上，從而使不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)得以分離。

7、特點(diǎn)：

（1）優(yōu)點(diǎn)：

1）屬于非變性蛋白質(zhì)分離技術(shù)。

2）分辨率高，區(qū)帶清晰且窄，分辨率至少可達(dá)0.01 pH單位。

3）受溶質(zhì)擴(kuò)散影響小，可消除分子擴(kuò)散引起的分離度下降。

4）加樣部位自由，重現(xiàn)性好。

5）操作簡單，電泳速度快。

6）可測定蛋白質(zhì)和多肽的等電點(diǎn)。

7）分離在較低的工作電壓下（20V/cm）進(jìn)行，可避免蛋白質(zhì)上專一結(jié)合（以共價(jià)鍵等強(qiáng)作用力結(jié)合，一定程度上依賴于蛋白質(zhì)構(gòu)象）的金屬在電場作用下丟失。這部分金屬大多構(gòu)成蛋白質(zhì)的活性中心或結(jié)構(gòu)中心，比非專一結(jié)合金屬具有更重要的生物學(xué)意義。

（2）缺點(diǎn)：

1）載體兩性電解質(zhì)合成過程復(fù)雜，影響蛋白質(zhì)點(diǎn)的位置，從而影響重復(fù)性。

2）凝膠灌制重復(fù)性差，影響結(jié)果重復(fù)性。

3）負(fù)極漂移現(xiàn)象使pH梯度不穩(wěn)定。

4）負(fù)極漂移現(xiàn)象使堿性蛋白質(zhì)無法聚焦。

5）需無鹽溶液，不適用于在等電點(diǎn)不溶解或發(fā)生變性的蛋白質(zhì)。

6）載體兩性電解質(zhì)的加入對產(chǎn)品產(chǎn)生污染。

7）操作過程中易發(fā)生凝膠脫水起皺現(xiàn)象。

8、載體兩性電解質(zhì)pH值梯度不穩(wěn)定的原因：

陰極漂移是指在等電聚焦電泳中pH梯度的堿性端逐漸消失的過程。反之，如果其酸性端逐漸消失則稱為陽極漂移。

為了闡明等電聚焦電泳中pH值梯度不穩(wěn)定的機(jī)制，提出了各種假說：

（1）載體兩性電解質(zhì)向陰、陽極的等速電泳遷移。

（2）在陰極因CO₂的吸附而引起陰極液組分和濃度的變化。

（3）在pH梯度的中性區(qū)域生成一段純水，水的等電聚焦導(dǎo)致水在電泳柱中的聚集并向兩端反流。

（4）不同等電點(diǎn)的載體兩性電解質(zhì)的選擇性缺陷而引起不穩(wěn)定。

（5）載體兩性電解質(zhì)帶電配體的結(jié)合或分離而引起不穩(wěn)定。

（6）載體兩性電解質(zhì)相互反應(yīng)的存在而引起不穩(wěn)定。

（7）相對遷移的氫離子和氫氧根離子濃度的不平衡。

9、注意事項(xiàng)：

（1）pH梯度的選擇。

（2）添加中性載體兩性電解質(zhì)。

（3）電流降到最小且恒定時(shí)盡快結(jié)束電泳。

（4）電泳結(jié)束后，檢測凝膠表面pH。

（5）蛋白質(zhì)在pI處形成沉淀，添加表面活性劑。

二、固相pH梯度等電聚焦電泳：

固相pH梯度等電聚焦電泳比載體兩性電解質(zhì)pH梯度等電聚焦電泳具有更高的分辨率，更大的上樣量，其分辨率可達(dá)0.001pH，是目前分辨率最高的電泳方法之一。

1、工作原理：

蛋白質(zhì)分子按照自己的pI位置在固相pH梯度中遷移，達(dá)到自己的等電點(diǎn)時(shí)停止遷移。

2、固相pH梯度的介質(zhì)：

固相pH梯度（IPG）的介質(zhì)是Immobilines試劑，是一些具有弱酸或弱堿性質(zhì)的丙烯酰胺衍生物，聚合行為與丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺相似。

3、固相pH梯度的形成：

Immobilines試劑的分子式為CH₂ = CH－CO－NH－R，其中R代表羧基或第三氨基，每個(gè)分子都有一個(gè)單一的酸性或堿性緩沖基團(tuán)與丙烯酰胺單連。分子一端的雙鍵可在聚合過程中共價(jià)鍵合鑲嵌到聚丙烯酰胺介質(zhì)中，是固相的，即使是在電場中也不會(huì)漂移。分子另一端的R基團(tuán)為弱酸或弱堿性的緩沖基團(tuán)，利用緩沖體系滴定終點(diǎn)附近一段pH范圍，可形成近似線性分布的pH = 3～10的緩沖體系。通過這種方式形成的固相pH梯度膠條不會(huì)發(fā)生電滲作用，可進(jìn)行特別穩(wěn)定的等電聚焦電泳分離。

固相pH梯度介質(zhì)不是兩性分子，在凝膠聚合時(shí)便形成pH梯度，不隨環(huán)境電場條件的改變而改變。

4、固相pH梯度的選擇：

常用方法是先寬后窄，先線性后非線性，先短后長，通過實(shí)驗(yàn)確定。

5、固相pH梯度膠條的泡脹：

泡脹的實(shí)質(zhì)是讓樣品能完全以可溶形式進(jìn)入固相pH梯度膠條內(nèi)，從而能進(jìn)行等電聚焦電泳分離。

6、聚焦時(shí)間的優(yōu)化：

理論上講，獲得最好的電泳譜圖質(zhì)量和重復(fù)性所需的最優(yōu)時(shí)間是等電聚焦電泳分離達(dá)到穩(wěn)定態(tài)所需的時(shí)間。

聚焦時(shí)間太短，會(huì)導(dǎo)致水平和垂直條紋的出現(xiàn)。過度聚焦雖不會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)向陰極漂移，但由于活性水轉(zhuǎn)運(yùn)會(huì)導(dǎo)致過多水在固相pH梯度膠表面滲出（電滲），而造成蛋白質(zhì)譜圖變性，在膠條堿性端產(chǎn)生水平條紋和蛋白質(zhì)丟失。

實(shí)際工作中，應(yīng)根據(jù)蛋白質(zhì)樣品、上樣量、pH范圍和膠條長度，通過實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)時(shí)間。

7、影響固相pH梯度膠條的蛋白質(zhì)載樣量的因素：

（1）待分析蛋白質(zhì)的量應(yīng)滿足質(zhì)譜分析。

（2）如果只是為了得到一張好的電泳譜圖，則無需考慮太多其它因素。

（3）待研究蛋白質(zhì)的豐度。

（4）對于較復(fù)雜的樣品，為了盡可能了解所包含的每種蛋白質(zhì)，需要反復(fù)實(shí)驗(yàn)才能完成。如果將待測樣品富集，則更易分析。

（5）固相pH梯度膠條的pH范圍。

8、特點(diǎn)：

（1）優(yōu)點(diǎn)：

1）固相pH梯度可窄至0.1pH，分辨率極高，可達(dá)0.001pH。

2）pH梯度穩(wěn)定，不漂移。

3）靈活性大，可隨意選擇pH梯度和斜率。

4）重復(fù)性好。

5）加樣量大。

6）樣品中鹽的干擾小。對堿性蛋白質(zhì)能很好的分離，無邊緣效應(yīng)，可用很窄（如5mm寬）的膠條聚焦，特別適合于雙向電泳的第一相。

（2）缺點(diǎn)：

1）固相 pH梯度灌膠技術(shù)復(fù)雜，只能使用聚丙烯酰胺凝膠。

2）電泳時(shí)需用高電壓，電泳時(shí)間長。

3）窄范圍pH測定困難，只能計(jì)算。

9、注意事項(xiàng)：

（1）溫度：20～30℃。

（2）電壓：梯度上升。

（3）需無鹽溶液，不適用于在等電點(diǎn)不溶解或發(fā)生變性的蛋白質(zhì)。

三、應(yīng)用：

分離對象只限于蛋白質(zhì)和其它兩性分子。

常用于同工酶的分離分析和pI測定。

   

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