影響高效毛細管區(qū)帶電泳色譜儀分離的操作條件有緩沖液、添加劑、分離電壓和分離溫度等。

一、緩沖液：

CZE分離過程在緩沖液中進行，緩沖液的選擇直接影響粒子的遷移和分離。

配制緩沖液時，必須使用高純蒸餾水和試劑。使用前要用0.45μm濾膜過濾以除去顆粒等。

1、緩沖液的選擇須遵循的要求：

（1）在所選擇的pH范圍內(nèi)有很好的緩沖容量。

（2）在檢測波長處無吸收或吸收值低。

（3）為達到有效的進樣和合適的電泳淌度，緩沖液pH值至少與被測組分的等電點相差l個pH單位。

（4）自身淌度低，即分子大而荷電小，以減少電流的產(chǎn)生。

（5）只要條件允許，盡可能采用酸性緩沖液。在低pH值下，吸附和電滲流都很小，毛細管涂層的壽命較長。

（6）與毛細管種類匹配，涂層毛細管只能在一定pH范圍內(nèi)使用。

2、常用緩沖液：

常用緩沖液有硼砂、磷酸鹽、檸檬酸鹽、琥珀酸鹽和醋酸鹽等。

3、緩沖液pH值：

（1）緩沖液pH值的選擇與樣品性質(zhì)有關(guān)。

1）通常酸性組分選擇在堿性條件下分離。

2）通常堿性組分選擇在酸性條件下分離。

3）蛋白質(zhì)、多肽和氨基酸等兩性物質(zhì)可選酸性（pH = 2）或堿性（pH＞9）分離介質(zhì)。

4）糖類樣品通常在pH = 9～11能獲得最優(yōu)分離。

5）羧酸或其它樣品多在pH = 5～9選擇分離條件。

（2）緩沖液pH值的選擇和毛細管種類有關(guān)。

很多涂層毛細管只能在一定pH范圍內(nèi)使用，如聚丙烯酰胺涂層毛細管只能在pH = 4～9使用，否則涂層易水解失效。

（3）在相同pH下，不同緩沖液的分離效果可能相差很大。

一般來說，能與樣品發(fā)生相互作用的試劑可能是最好的。如分離糖類和DNA等分子時應(yīng)優(yōu)先使用硼酸鹽緩沖液，因為硼酸根能與糖羥基形成配位鍵，增加糖的負電荷和分離度。硼酸鹽緩沖液也適用于分離其它含鄰羥基和多羥基的化合物。

（4）為了選擇合適的pH值，需要用pH調(diào)節(jié)劑調(diào)整介質(zhì)的酸堿性。

由于多數(shù)緩沖試劑是酸性物質(zhì)如磷酸，所以pH調(diào)節(jié)劑主要是堿類。常用pH調(diào)節(jié)劑有NaOH、KOH和Tris等。也可用胺和醇胺等有機堿如乙醇胺和乙二胺。如果緩沖試劑為堿類，可用酸作為調(diào)節(jié)劑，盡量使用弱酸如H₃PO₄。

緩沖試劑和調(diào)節(jié)劑的濃度對改善分離、抑制吸附和控制焦耳熱等都有影響。一般緩沖試劑的濃度在10～200mmol/L，有時為了抑制蛋白質(zhì)等的吸附作用，濃度可高達500mmol/L（此時應(yīng)減少分離電壓）。電導(dǎo)率大的緩沖試劑如磷酸鹽和硼酸鹽等的濃度一般在20mmol/L，電導(dǎo)率小的緩沖試劑如硼酸的濃度可在100mmol/L以上。

二、添加劑：

如果緩沖液經(jīng)各種參數(shù)優(yōu)化后仍無法給出良好的分離結(jié)果，可加入添加劑以改善分離。常用添加劑有：

1、無機電解質(zhì)：NaCl和KCl等。

2、有機溶劑：甲醇和乙腈等。

3、非電解質(zhì)高分子：纖維素、多糖、聚乙烯醇和Triton X－100等。

4.、功能性添加劑：手性冠醚和環(huán)糊精等。

三、分離電壓：

分離效率與電壓間存在極大值。極大電壓通常也是最優(yōu)工作電壓。

當毛細管很細或緩沖液電導(dǎo)很低時，極大電壓可能會超出儀器范圍。此時沒有最優(yōu)電壓，可選擇儀器允許的最大輸出電壓。

當毛細管較粗或緩沖液電導(dǎo)較高時，極大電壓可能很小，若此時分離度很高，可選擇大于極大值的電壓進行分離。

四、分離溫度：

毛細管的溫度不僅影響分離的重視性，而且影響分離效率。溫度選擇應(yīng)考慮熱效應(yīng)、分析重現(xiàn)性、分離效率和分離介質(zhì)對溫度的限制等因素。

溫度應(yīng)通過實驗確定。多數(shù)情況下，在20～30℃進行電泳能獲得良好的分離效果。一些糖類樣品需要高于室溫的分離條件，一些樣品如蛋白質(zhì)等可能需要低于室溫的分離條件。

   

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