高效液相色譜儀建立分析方法的一般步驟包括了解樣品的基本情況、明確分離目的、樣品需要的預(yù)處理、檢測器的選擇、分離模式的選擇、固定相和流動相的選擇等。

一、了解樣品的基本情況：

樣品的基本情況主要包括樣品所含化合物的種類（官能團(tuán)）、數(shù)目、分子量、pH值、UV光譜圖、樣品基體的性質(zhì)（溶劑和填充物等）、化合物在有關(guān)樣品中的濃度范圍、樣品的溶解度等。

二、明確分離目的：

1、主要目的是分析，還是回收樣品組分。

2、是否已知樣品所有成分的化學(xué)特性或是否需定性分析。

3、是否有必要解析出樣品的所有成分，如對映體、非對映體、同系物和痕量雜質(zhì)等。

4、如需做定量分析，精度需多高。

5、本法將適用于幾種樣品的分析，還是許多種樣品的分析。

6、將使用最終方法的常規(guī)實驗室中已有哪些HPLC設(shè)備和技術(shù)。

三、樣品需要的預(yù)處理：

除非樣品是適于直接進(jìn)樣的溶液，否則，高效液相色譜分析前均需進(jìn)行某種形式的預(yù)處理。如有的樣品需加入緩沖溶液以調(diào)節(jié)pH值；有的樣品含有干擾物質(zhì)或損柱劑而必須在進(jìn)樣前將其去除；有的樣品本身是固體，需要用溶劑溶解，為了保證最終的樣品溶液與流動相的成分盡量相近，一般最好直接用流動相溶解或稀釋樣品。

四、檢測器的選擇：

不同的分離目的對檢測的要求不同。如檢測單一組分，理想的檢測器應(yīng)僅對所測成分響應(yīng)，而其它任何成分均不出峰。如是定性分析或是制備色譜，最好有通用型檢測器，以便能檢測到混合物中的各種成分。

僅對分析而言，檢測器靈敏度越高，最低檢出量越小越好。如是制備分離，則檢測器的靈敏度沒必要很高。

應(yīng)盡量使用紫外檢測器（UV），因為目前一般的HPLC都配有UV，UV方便且受外界影響小。如被測化合物沒有足夠的UV生色團(tuán)，則應(yīng)考慮使用其它檢測手段，如示差折光檢測檢測器、熒光檢測器和電化學(xué)檢測器等。如果實在找不到合適的檢測器，才可以考慮將樣品衍生化為有UV吸收或有熒光的產(chǎn)物，然后用UV或熒光檢測。

五、分離模式的選擇：

在充分考慮樣品的溶解度、分子量、分子結(jié)構(gòu)和極性差異的基礎(chǔ)上，確定高效液相色譜的分離模式。

六、固定相和流動相的選擇：

在實際色譜分析過程中，分離模式確立后，應(yīng)該選擇合適的固定相與流動相，這也是十分重要的。

   

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