高效毛細(xì)管電泳色譜儀（CE）是以毛細(xì)管為分離通道，以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，利用荷電粒子之間的淌度差異和分配系數(shù)差異進(jìn)行分離，具有高效、分辨率高、重復(fù)性好、速度快和易于自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)。質(zhì)譜儀（MS）是通過(guò)對(duì)樣品離子的質(zhì)量和強(qiáng)度的測(cè)定進(jìn)行定量和結(jié)構(gòu)分析，具有靈敏度高和速度快等優(yōu)點(diǎn)。CE與MS聯(lián)用綜合了兩者的優(yōu)點(diǎn)，是分析生物大分子的有力工具。

一、儀器結(jié)構(gòu)：

在CE－MS聯(lián)用中，毛細(xì)管區(qū)帶電泳最為常用，其它如毛細(xì)管凝膠電泳、毛細(xì)管膠束電動(dòng)色譜、毛細(xì)管等電聚焦電泳和毛細(xì)管等速電泳等應(yīng)用較少。電子噴霧離子化（ESI）可用于檢測(cè)多種高質(zhì)量的帶電分子，從CE分離出來(lái)的分子經(jīng)過(guò)接口可直接進(jìn)入MS，是MS首選的離子源。

二、接口技術(shù)：

CE－ESI－MS接口的目標(biāo)是獲得穩(wěn)定的霧流和高效的離子化，是影響整個(gè)檢測(cè)的關(guān)鍵因素之一。由于CE需要較高離子強(qiáng)度和揮發(fā)性低的緩沖液，而ESI需要較低鹽濃度才能獲得好的霧化和離子化。因此，接口技術(shù)必須優(yōu)化，以盡可能提供好的電子接觸，盡量減少對(duì)CE分離效率的影響。此外，每一種接口應(yīng)選擇相應(yīng)的緩沖液。CE－ESI－MS接口有同軸液體鞘流接口、無(wú)鞘接口和液體連接接口三種類型。

1、同軸液體鞘流接口：

同軸液體鞘流接口是連接CE與ESI－MS最常見(jiàn)的接口。

（1）結(jié)構(gòu)：

在CE毛細(xì)管末端外套一個(gè)同心不銹鋼毛細(xì)管套，內(nèi)充鞘液。在此不銹鋼套外再套一個(gè)同心不銹鋼套，內(nèi)通鞘氣。鞘液和CE緩沖液在毛細(xì)管的尖端混合，同時(shí)被鞘氣霧化。鞘液流量通常為每分鐘數(shù)納升至數(shù)微升，顯著高于CE的流速。由于鞘液的稀釋作用，使霧流穩(wěn)定性得到改善。理想的鞘液緩沖液的鹽濃度應(yīng)在高分離（高鹽濃度）和高霧化（低鹽濃度）之間進(jìn)行優(yōu)化。由于鞘液在霧化過(guò)程中完全蒸發(fā)，鞘液的稀釋作用并不顯著降低檢測(cè)靈敏度，但混合液體的體積應(yīng)盡可能小，以避免譜帶展寬。

（2）特點(diǎn)：

由于鞘液對(duì)CE流出物的稀釋作用而降低檢測(cè)靈敏度，鞘液的成分和濃度對(duì)CE分離均有影響。

2、無(wú)鞘接口：

（1）結(jié)構(gòu)：

將CE毛細(xì)管末端做成尖細(xì)狀，以獲得穩(wěn)定的電子霧化。

在CE毛細(xì)管末端外套一個(gè)同心毛細(xì)管套，內(nèi)通鞘氣。此接口的難點(diǎn)是不易同時(shí)保持CE和ESI的電路循環(huán)，為此，在毛細(xì)管末端粘上金絲或鍍一層金，但金的粘著力差，易被機(jī)械的和電子的原因除去。

（2）特點(diǎn)：

接口性能差且壽命短。

3、液體連接接口：

（1）結(jié)構(gòu)：

將CE毛細(xì)管末端與一個(gè)直徑為10～20μm的槽垂直相連，槽內(nèi)充有CE緩沖液。與毛細(xì)管末端相對(duì)的槽的另一端接上ESI。

（2）特點(diǎn)：

可通過(guò)任意調(diào)節(jié)槽內(nèi)液體流速以改善ESI效果，而這通常是以譜帶展寬和分離效能降低為代價(jià)取得的。

此接口技術(shù)難度較大，現(xiàn)僅用于芯片CE與MS聯(lián)用中。

三、樣品預(yù)濃縮方法：

由于CE受進(jìn)樣量的限制，對(duì)一些含量較低的樣品的檢測(cè)靈敏度仍顯不足。因此，在樣品分離前應(yīng)進(jìn)行預(yù)濃縮。

樣品預(yù)濃縮方法有基于電泳原理的預(yù)濃縮和基于色譜原理的預(yù)濃縮。

1、基于電泳原理的預(yù)濃縮：

（1）堆積進(jìn)樣：

1）原理：

根據(jù)樣品塞子與CE緩沖液的導(dǎo)電性差異來(lái)實(shí)現(xiàn)。若樣品的導(dǎo)電性小于CE緩沖液，樣品塞子上的電場(chǎng)強(qiáng)度高于緩沖液，樣品塞子中離子的遷移速度大于緩沖液。若樣品以?shī)A心餅干方式進(jìn)行CE電泳，則樣品在緩沖液中聚焦?jié)饪s。

2）特點(diǎn)：

可顯著增加樣品的輸出信號(hào)，約達(dá)20倍。

（2）場(chǎng)放大進(jìn)樣：

1）原理：

場(chǎng)放大進(jìn)樣又稱電場(chǎng)聚焦進(jìn)樣，類似于樣品堆積進(jìn)樣，也是根據(jù)樣品與CE緩沖液的遷移速度差異來(lái)實(shí)現(xiàn)，差別是進(jìn)樣步驟和聚焦過(guò)程。場(chǎng)放大進(jìn)樣是在整個(gè)進(jìn)樣過(guò)程都施加電壓，聚焦發(fā)生在用緩沖液瓶更換為樣品瓶直到CE電泳開(kāi)始的一段時(shí)間。即場(chǎng)放大進(jìn)樣是根據(jù)樣品的遷移速度與電場(chǎng)強(qiáng)度成正比的特點(diǎn)，在CE電泳初期，使樣品從高電場(chǎng)突然轉(zhuǎn)入低電場(chǎng)，因減速而堆積在電場(chǎng)交界處，使區(qū)帶變窄，濃度提高，而達(dá)到聚焦?jié)饪s的目的。

2）特點(diǎn)：

可突破樣品堆積進(jìn)樣70%毛細(xì)管體積的進(jìn)樣量限制，使樣品濃縮約100倍，但有進(jìn)樣歧視現(xiàn)象。

（3）等速電泳進(jìn)樣：

等速電泳進(jìn)樣既是CE的一種電泳模式，又可作為預(yù)濃縮的一種方法。采用等速電泳進(jìn)樣進(jìn)行樣品預(yù)濃縮有耦合毛細(xì)管等速進(jìn)樣和瞬時(shí)毛細(xì)管等速進(jìn)樣兩種模式。

1）耦合毛細(xì)管等速進(jìn)樣：

①原理：將兩根毛細(xì)管相連接，一根用作等速電泳（ITP），另一根用作CE電泳。

②特點(diǎn)：僅適用于水溶性樣品且裝置復(fù)雜，不常用。

2）瞬時(shí)毛細(xì)管等速進(jìn)樣：

①原理：用一根毛細(xì)管既作ITP電泳，又作CE電泳。

第一步，將樣品溶解在前導(dǎo)電解質(zhì)（通常是氨溶液）中，以壓力進(jìn)樣方式將樣品導(dǎo)入CE毛細(xì)管中。然后將毛細(xì)管插入尾隨電解質(zhì)瓶（通常為醋酸）中，在毛細(xì)管兩端施加約30kV電壓，使前導(dǎo)電解質(zhì)、樣品和尾隨電解質(zhì)向陰極移動(dòng)，由于淌度差異，樣品被聚焦在前導(dǎo)電解質(zhì)和和尾隨電解質(zhì)之間。

第二步，用前導(dǎo)電解質(zhì)作為背景電解質(zhì)進(jìn)行CE電泳。

②特點(diǎn)：對(duì)蛋白質(zhì)和多肽均可進(jìn)行分析，極具發(fā)展前景。

2、基于色譜原理的預(yù)濃縮：

（1）固相萃取：

1）原理：

固相萃取常用C₂、C₈和C₁₈作吸附劑，萃取床連接在轉(zhuǎn)移毛細(xì)管和CE之間。樣品通過(guò)轉(zhuǎn)移毛細(xì)管進(jìn)入萃取床，用電泳緩沖液沖洗樣品，隨后注入50～100nL有機(jī)修飾劑塞子使樣品洗脫進(jìn)入CE。有機(jī)修飾劑可引起樣品堆積。

2）特點(diǎn)：

可顯著降低檢測(cè)下限，但會(huì)使分離度降低，譜帶展寬，峰拖尾。

（2）液液分配色譜：

1）根據(jù)液液分配色譜和電泳進(jìn)行濃縮：

①步驟：

第一步，將樣品溶解在非極性溶劑（如乙酸乙酯）中，以電動(dòng)進(jìn)樣方式將樣品導(dǎo)入CE毛細(xì)管中。同時(shí)，由于液體對(duì)流作用，可避免大量乙酸乙酯進(jìn)入毛細(xì)管中。

第二步，將毛細(xì)管插入尾隨電解質(zhì)瓶中，在電場(chǎng)作用下開(kāi)始聚焦。

第三步，達(dá)到穩(wěn)態(tài)后，將毛細(xì)管插入前導(dǎo)電解質(zhì)瓶中進(jìn)行CE電泳。

②特點(diǎn)：

此法濃縮能力高達(dá)1000倍，但蛋白質(zhì)易變性，在非極性相中易沉淀。

2）用一張浸有非極性溶劑（如十一碳烷）的聚丙烯膜將預(yù)濃縮室隔成兩個(gè)部分：一部分是供相，作為樣品進(jìn)入相；另一部分是受相，作為富集相。兩相均為水溶性。通過(guò)調(diào)節(jié)兩相pH，使樣品在供相中不帶電荷，進(jìn)入受相則帶電荷，從而達(dá)到濃縮目的。

（3）中空纖維液相微萃取：

1）原理：

利用中空纖維壁能選擇性阻止一定分子量的物質(zhì)通過(guò)的特性而達(dá)到濃縮目的。

將中空纖維通過(guò)Teflon管與CE毛細(xì)管相連接，以電動(dòng)方式進(jìn)樣，由于蛋白質(zhì)不能透過(guò)中空纖維壁而聚集在毛細(xì)管入口端。濃縮完成后，關(guān)閉進(jìn)樣電場(chǎng)，接通分離電場(chǎng)進(jìn)行CE電泳。

2）特點(diǎn)：

此法速度快，濃縮效率高，可除掉一些小分子物質(zhì)（如鹽類），對(duì)痕量蛋白質(zhì)的檢測(cè)十分有效。

（4）親和色譜：

1）原理：

將親和色譜柱與CE毛細(xì)管相連接，以壓力方式進(jìn)樣，然后根據(jù)樣品性質(zhì)，以小體積的有機(jī)溶劑或特殊緩沖液進(jìn)行洗脫，進(jìn)入CE。

2）特點(diǎn)：

此法進(jìn)樣量可達(dá)50μL，濃縮高達(dá)100～500倍，可有效地降低檢測(cè)下限。

CE－MS聯(lián)用大大拓寬了CE和MS的應(yīng)用領(lǐng)域，但CE固有的缺陷并未克服。在DNA分離時(shí)，極高的電場(chǎng)強(qiáng)度容易使較長(zhǎng)的DNA發(fā)生伸展改變呈棒狀，而降低分離效果。現(xiàn)有的接口類型都有不同程度的缺陷，隨著接口技術(shù)的不斷改進(jìn)、芯片CE與MS聯(lián)用技術(shù)的完善和新濃縮技術(shù)（如分子印跡）的應(yīng)用，CE－MS在蛋白質(zhì)組學(xué)、化學(xué)藥物研究和臨床實(shí)驗(yàn)診斷等領(lǐng)域已顯示了廣闊的前景，正成為分析工作者的重要工具之一。

   

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