高效液相色譜儀梯度洗脫（溶劑程序）是通過改變流動相組成來調整組分k值，改變分離因子α值，以達到在最短時間內實現(xiàn)最優(yōu)分離的目的。

一、對色譜泵的要求：

色譜泵在任何情況下都要保持高精度。

1、流速要穩(wěn)定平滑，重現(xiàn)性好。

2、溶劑混合要可靠充分：

（1）準確、重現(xiàn)的自動溶劑混合。

（2）準確、重現(xiàn)的梯度形成。

3、有效的流速范圍：

制備柱和微柱色譜更為關注。

4、滯后體積：

僅應用于梯度實驗。

二、梯度洗脫的主要條件：

1、A流動相－弱溶劑組成。

2、B流動相－強溶劑組成。

3、梯度洗脫時間。

4、線性、凸型和凹型等梯度曲線。

三、梯度洗脫的特點：

1、可改善分離，加快分析速度。

2、可改善峰形，減少拖尾，有利于痕量組分的分析。

3、可增加峰容量。

4、強烈滯留的組分不容易殘留在柱上，可保持柱性能長期良好。

5、下次分析時，流動相需要平衡一段時間。不同溶劑的紫外吸收程度稍有差異，可能會引起基線漂移。

四、梯度滯后體積的影響：

1、滯后體積太大會使梯度變化延遲。

（1）如滯后體積為2mL，流速為1mL/min，實際梯度比設置值晚2min響應，可以接受。

（2）對微柱色譜影響更大，如滯后體積為2mL，流速為0.1mL/min，實際梯度比設置值晚20min響應，不能接受。

2、滯后體積不同使方法轉換麻煩：

（1）滯后體積比文獻值大或小都會使方法不能重現(xiàn)。

（2）滯后體積變化會導致梯度重現(xiàn)性不好。

3、普通分析型液相色譜的滯后體積為2～4mL。

4、設計不好的HPLC系統(tǒng)，滯后體積會隨反壓變化，使梯度的準確性不好，方法的適應性不好。

5、采用靜態(tài)梯度混合器固定滯后體積，可明顯改善梯度特性。

五、確定最優(yōu)化梯度洗脫條件的步驟：

1、在全濃度范圍內進行梯度洗脫，要確定待分離組分在梯度變化范圍內可以被洗脫，初步觀察組分的位置。

2、確定梯度使用范圍和ΔΦ大小。Φ為強溶劑在洗脫液中所占的體積百分數(shù)。

3、選擇幾個梯度洗脫時間，確定S值。S是與強溶劑和樣品有關的參數(shù)，對于RPLC分離小分子，S值一般為3～5。

4、確定梯度洗脫時間下的最優(yōu)值（梯度洗脫時間小，流速大）。

5、可以進行非線性梯度洗脫，使待分離組分與其它物質盡可能分開。

6、若分離效果不好，可以調整pH值、鹽類型和有機溶劑組成等，使組分峰與其它峰盡可能分開。

六、梯度洗脫操作注意事項：

1、兩個流動相溶劑要能互溶，即極性不要相差太大。

2、吸附色譜只能是在小范圍內變化，因此吸附色譜很少用梯度洗脫。

3、示差折光檢測器不適應梯度洗脫。

七、程序升溫在HPLC中沒有受到青睞的原因：

在HPLC中，最低溫度和最高溫度受流動相粘度和沸點的限制，同時溫度效應比較小。

   

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