高效毛細(xì)管電泳色譜儀簡(jiǎn)稱毛細(xì)管電泳儀（CE），是以毛細(xì)管為分離通道，以電滲流為驅(qū)動(dòng)力，利用帶電粒子之間的電泳淌度差異和分配系數(shù)差異進(jìn)行分離，電泳淌度不同是電泳分離的內(nèi)因和前提。

一、電泳：

1、電泳現(xiàn)象：

電泳現(xiàn)象是指帶電粒子在電場(chǎng)的作用下，向著與其電性相反的電極方向移動(dòng)的現(xiàn)象。

2、電泳技術(shù)：

電泳技術(shù)是指利用電泳現(xiàn)象對(duì)混合物進(jìn)行分離分析的技術(shù)。

3、電泳速度v_ep：

電泳速度v_ep是指帶電粒子在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下泳動(dòng)的速度。

帶電粒子在電場(chǎng)中遷移時(shí)，所受的電場(chǎng)力為F_E：

F_E = qE

式中：q為帶電粒子的有效電荷，E為電場(chǎng)強(qiáng)度。

帶電粒子在溶液中運(yùn)動(dòng)時(shí)受到的阻力即摩擦力F_f：

F_f = fv_ep

式中：f為摩擦系數(shù)，其大小與帶電粒子的大小、形狀和電泳介質(zhì)粘度有關(guān)。

對(duì)于球形粒子：f = 6πηr

對(duì)于棒狀粒子：f = 4πηr

式中：η為電泳介質(zhì)粘度，r為粒子的動(dòng)力學(xué)半徑。

平衡時(shí)，電場(chǎng)力和摩擦力相等，即：

qE = fv_ep

對(duì)于球形粒子：v_ep =（qE）/f =（qE）/（6πηr）

對(duì)于棒狀粒子：v_ep =（qE）/f =（qE）/（4πηr）

在同一電場(chǎng)中，粒子的電荷性質(zhì)不同，泳動(dòng)方向不同；粒子的帶電量不同，泳動(dòng)速度不同；粒子的分子量不同，泳動(dòng)速度不同；粒子的形狀不同，泳動(dòng)速度不同。因此，不同的粒子可相互分離。

4、電泳淌度μ_ep：

帶電粒子在電場(chǎng)中移動(dòng)的快慢用電泳淌度來表示，一般不用電泳速度表示。

電泳淌度是指帶電粒子在給定的溶液中，在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的電泳速度，又稱電泳遷移率或泳動(dòng)度。用μ_ep表示。

對(duì)于球形粒子：μ_ep = v_ep/E = q/（6πηr）

對(duì)于棒狀粒子：μ_ep = v_ep/E = q/（4πηr）

帶電粒子的電泳速度等于粒子的電泳淌度和電場(chǎng)強(qiáng)度的乘積，即：

v_ep =μ_epE

因此，電泳淌度不同是電泳分離的內(nèi)因和前提。

電泳淌度有絕對(duì)電泳淌度、有效電泳淌度和表觀電泳淌度。

（1）絕對(duì)電泳淌度µ_ab：

絕對(duì)電泳淌度是指在溶液無限稀釋時(shí)，帶電粒子在單位電場(chǎng)強(qiáng)度下的平均電泳速度。它是該帶電粒子在一定溶液中的一個(gè)特征物理常數(shù)。

（2）有效電泳淌度µ_ef：

CE不可能在無限稀釋而又沒有其它帶電粒子和酸度等條件下進(jìn)行電泳，有效電泳淌度是帶電粒子的實(shí)際電泳淌度。

（3）表觀電泳淌度μ_ap：

在有電滲存在下，帶電粒子的實(shí)際電泳淌度稱為表觀電泳淌度或凈淌度，是有效電泳淌度µ_ef和電滲淌度µ_eo的矢量和。

二、CE中的Zeta電位：

1、毛細(xì)管內(nèi)表面的Zeta電位：

毛細(xì)管一般采用石英管，管內(nèi)表面為硅膠，當(dāng)內(nèi)充緩沖液pH＞3時(shí)，管內(nèi)表面的硅醇基（－SiOH）離解成硅醇基陰離子（－SiOˉ），使管內(nèi)表面帶負(fù)電荷，溶液表面帶正電荷，在管內(nèi)表面和溶液之間形成雙電層。根據(jù)Stern雙電層理論可將雙電層分為兩部分，即Stern層和擴(kuò)散層。

在雙電層中，由于吸附而緊貼在毛細(xì)管內(nèi)表面的陽離子組成的離子層稱為Stern層，可游離的陽離子組成的離子層稱為擴(kuò)散層。Stern層與擴(kuò)散層發(fā)生相對(duì)移動(dòng)的界面稱為滑動(dòng)面，滑動(dòng)面和毛細(xì)管內(nèi)表面的電位差稱為毛細(xì)管內(nèi)表面的Zeta電位（ζ－電位）。毛細(xì)管內(nèi)表面的Zeta電位正比于雙電層厚度和滑動(dòng)面的有效電荷密度，反比于電泳介質(zhì)的介電常數(shù)。

2、膠體粒子的Zeta電位：

在膠體中，由于分散粒子表面帶電荷而吸引周圍的反離子，這些反離子在兩相界面呈擴(kuò)散狀態(tài)分布而形成雙電層。

在雙電層中，由于吸附而緊貼在分散粒子表面的反離子組成的離子層稱為Stern層。Stern層中的反離子和分散粒子緊緊地結(jié)合在一起，在電場(chǎng)作用下，與分散粒子作為一個(gè)整體移動(dòng)。Stern層相對(duì)于遠(yuǎn)離滑動(dòng)面的液體中某點(diǎn)的電位稱為Stern電位。

在雙電層中，可游離的反離子組成的離子層稱為擴(kuò)散層，游離離子的電荷密度隨著與分散粒子表面的距離的增大而急劇減小。擴(kuò)散層中的反離子不緊密的與分散粒子相互吸附，在電場(chǎng)作用下，向相反的電極方向移動(dòng)。Stern層與擴(kuò)散層發(fā)生相對(duì)移動(dòng)的界面稱為滑動(dòng)面，滑動(dòng)面和遠(yuǎn)離該界面的液體中某點(diǎn)的電位差稱為該點(diǎn)的Zeta電位（ζ－電位）。

Zeta電位是表征膠體分散系穩(wěn)定性的重要指標(biāo)。

三、電滲：

1、電滲現(xiàn)象：

電滲現(xiàn)象是指在電場(chǎng)作用下，毛細(xì)管中液體沿毛細(xì)管內(nèi)表面或或固相多孔物質(zhì)內(nèi)液體沿固體表面移動(dòng)的現(xiàn)象。

毛細(xì)管一般采用石英管，管內(nèi)表面為硅膠，當(dāng)內(nèi)充緩沖液pH＞3時(shí)，管內(nèi)表面的硅醇基（－SiOH）離解成硅醇基陰離子（－SiOˉ），使管內(nèi)表面帶負(fù)電荷，溶液表面帶正電荷，在管內(nèi)表面和溶液之間形成雙電層。在外電場(chǎng)作用下，溶液中溶劑化了的陽離子向負(fù)極移動(dòng)，使毛細(xì)管中的溶液整體向負(fù)極移動(dòng)。這就是CE中的電滲現(xiàn)象。

2、電滲流（EOF）：

電滲現(xiàn)象中整體移動(dòng)著的液體稱為電滲流。

電滲流來源于外電場(chǎng)對(duì)毛細(xì)管內(nèi)表面和溶液之間雙電層的作用。擴(kuò)散層中的陽離子相對(duì)于毛細(xì)管內(nèi)表面的負(fù)電荷形成一個(gè)圓筒形的陽離子鞘，在外電場(chǎng)作用下，溶液中溶劑化了的陽離子沿滑動(dòng)面作相對(duì)運(yùn)動(dòng)，攜帶著溶劑一起向負(fù)極移動(dòng)，而形成電滲流。

電滲流是CE的主要驅(qū)動(dòng)力，沿毛細(xì)管均勻分布，電滲流的徑向分布幾乎是均勻的，使整個(gè)液體象塞子一樣以均勻的速度向前運(yùn)動(dòng)，呈平面流（塞式流形）。電滲流速度除在管內(nèi)表面附近因摩擦力迅速減小到零以外，其余部分幾乎處處相等，引起的譜峰展寬很小。而HPLC流動(dòng)相的流形為拋物線形的層流，在管內(nèi)表面處的速度為零，管中心的速度是平均速度的兩倍，引起的譜峰展寬較大。這是CE能獲得比HPLC更高分離效率的主要原因。

電滲流使不同電性的粒子均向負(fù)極移動(dòng)，中性分子也隨電滲流一起移動(dòng)。

3、電滲流速度v_eo：

（1）電滲流大小：

電滲流大小用電滲流速度v_eo表示，其大小決定于電滲淌度μ_eo和電場(chǎng)強(qiáng)度E。即：

v_eo =μ_eoE =（εζ/η）E

v_eo可通過實(shí)驗(yàn)測(cè)定：

v_eo = L_ef/t_eo

式中：L_ef為毛細(xì)管有效長(zhǎng)度，t_eo為電滲標(biāo)記物（中性物質(zhì)）的遷移時(shí)間。

（2）電滲流方向：

電滲流方向取決于毛細(xì)管內(nèi)表面的電荷性質(zhì)。

石英毛細(xì)管內(nèi)表面帶負(fù)電荷，溶液表面帶正電荷，電滲流流向負(fù)極。但如果將毛細(xì)管內(nèi)表面改性和加電滲流反向劑，使管內(nèi)表面帶正電荷，則溶液表面帶負(fù)電荷，電滲流流向正極。

1）毛細(xì)管內(nèi)表面改性：在毛細(xì)管內(nèi)表面鍵合或涂漬一層陽離子表面活性劑。

2）加電滲流反向劑：在運(yùn)行緩沖液中加入大量陽離子表面活性劑，使毛細(xì)管內(nèi)表面帶正電荷，溶液表面帶負(fù)電荷，電滲流流向正極。

4、電滲淌度μ_eo：

μ_eo =εζ/η

電滲淌度又稱電滲遷移率，取決于毛細(xì)管內(nèi)表面的Zeta電位、電泳介質(zhì)的介電常數(shù)和電泳介質(zhì)粘度，與E無關(guān)。

5、電滲流作用：

電滲流通常流向負(fù)極，電滲流速度約是一般離子電泳速度的5～7倍。各種粒子在毛細(xì)管中的遷移速度是電滲流速度和電泳速度的矢量和，稱為表觀電泳速度v_ap。各種粒子在毛細(xì)管中的表觀電泳速度v_ap分別為：

陽離子：v_ap = v_eo+ v_ep，陽離子電泳方向與電滲流方向一致。

陰離子：v_ap = v_eo－v_ep，陰離子電泳方向與電滲流方向相反。

中性粒子：v_ap = v_eo，中性粒子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流方向一致。

當(dāng)樣品從正極端注入毛細(xì)管中時(shí)，不同粒子將以不同速度向負(fù)極遷移，從負(fù)極端先后流出毛細(xì)管，出峰順序依次是陽離子、中性粒子和陰離子。中性粒子無電泳現(xiàn)象，隨電滲流同行，在陽離子后流出，但不同結(jié)構(gòu)的中性粒子無法相互分離。

電滲流在CE中起著極其重要的作用：

（1）電滲流具有象HPLC中泵一樣的作用，驅(qū)動(dòng)粒子前進(jìn)，加上不同粒子電泳速度和方向的差異，完成陽離子、陰離子和中性粒子的分離。

（2）改變電滲流的大小和方向，可改變分離效率和選擇性。這是CE優(yōu)化分離的重要因素。

（3）電滲流的微小變化影響分離結(jié)果的重現(xiàn)性（遷移時(shí)間和峰面積）。

6、控制電滲流的三個(gè)重要手段：

（1）毛細(xì)管內(nèi)表面改性：

在毛細(xì)管內(nèi)表面鍵合或涂漬一層陽離子表面活性劑，消除電滲流的影響。

（2）加添加劑：

1）有機(jī)溶劑可降低電滲流的大小，增加分離的有效距離。

2）表面活性劑可徹底改變電滲流方向和大小。主要是在陰離子分析時(shí)使用。

（3）改變pH：

可調(diào)整電滲流大小。

1）當(dāng)pH＜3時(shí)，電滲流很小。

2）當(dāng)pH＞10時(shí)，電滲流基本不增加。

四、影響電泳遷移速度的因素：

影響電泳遷移速度的因素有粒子所帶凈電荷量、粒子大小及形狀、毛細(xì)管材質(zhì)、載體、電場(chǎng)強(qiáng)度、緩溶液pH值、緩沖液離子強(qiáng)度、添加劑、溫度和電滲流等。

1、粒子所帶凈電荷量：

粒子的遷移速度與粒子所帶凈電荷量成正比。

2、粒子大小及形狀：

粒子直徑小，接近于球形，遷移速度快。

一般來說，遷移速度為超螺旋環(huán)狀DNA＞線狀DNA＞單鏈開環(huán)DNA。

3、毛細(xì)管材質(zhì)：

不同材料毛細(xì)管內(nèi)表面的電荷特性不同，產(chǎn)生的電滲流大小不同。

4、載體：

（1）載體孔徑：

載體孔徑越小，粒子在移動(dòng)的過程中受到的阻力越大。

小孔徑載體具有分子篩作用。

（2）載體粘性：

阻礙泳動(dòng)并有吸附作用。

載體的吸附作用要小，否則電場(chǎng)強(qiáng)度不均勻，影響區(qū)帶分離。

（3）載體純度：

載體純度影響聚焦效果。

酸度影響毛細(xì)管內(nèi)表面Si－OH基的電離。特別是在pH = 4～7范圍內(nèi)影響更顯著，此時(shí)溶液pH值與電滲速度近似成線性關(guān)系。

5、電場(chǎng)強(qiáng)度：

一般來說，電場(chǎng)強(qiáng)度越大，粒子的遷移速度越大。

6、緩溶液pH值：

緩沖液pH值是影響粒子電泳淌度的最主要因素。

（1）緩沖液pH值決定粒子的解離程度，也決定粒子的帶電性質(zhì)和所帶凈電荷量。

（2）緩沖液pH值影響毛細(xì)管內(nèi)表面電荷多少，影響電滲流大小和遷移速度。

緩沖液pH值增大時(shí)，毛細(xì)管內(nèi)表面解離增多，電荷密度增加，Zeta電位增大，電滲流速度增大，當(dāng)pH = 7時(shí)達(dá)到最大。當(dāng)pH＜3時(shí)，完全被氫離子中和，管內(nèi)表面呈電中性，電滲流速度為零。

7、緩沖液離子強(qiáng)度：

緩沖液離子強(qiáng)度越大，粒子的遷移率越小，電泳區(qū)帶窄而清晰。原因是緩沖液離子強(qiáng)度增大，帶電離子會(huì)吸引相反符號(hào)的離子聚集在其周圍，形成一個(gè)與該離子符號(hào)相反的離子氛，使該離子向相反的方向運(yùn)動(dòng)，從而降低該離子的遷移率。緩沖液離子強(qiáng)度過大，電流過大，產(chǎn)生的熱量過多，會(huì)使電泳區(qū)帶變寬，蛋白質(zhì)變性。

緩沖液離子強(qiáng)度越小，粒子的遷移率越大，電泳區(qū)帶寬而邊緣模糊。緩沖液離子強(qiáng)度過小，會(huì)降低緩沖液的總濃度和緩沖容量，不易維持緩沖液pH值，影響粒子的帶電量；蛋白質(zhì)分子之間有時(shí)會(huì)發(fā)生靜電作用，形成更大的分子團(tuán)，影響遷移率。

8、添加劑：

添加劑有中性鹽、表面活性劑和有機(jī)溶劑等。

（1）加入濃度較大的中性鹽如K₂SO₄，溶液離子強(qiáng)度增大，電滲流速度減小。

（2）加入表面活性劑，可改變電滲流大小和方向。

1）某些陽離子表面活性劑使電滲流減小。

2）某些陰離子表面活性劑如十二烷基硫酸鈉（SDS），可使管內(nèi)表面負(fù)電荷增加，電滲流增大。

（3）加入有機(jī)溶劑如甲醇和乙腈，使溶液粘度減小，電滲流增大。

（4）加入添加劑，增加疏水組分的溶解度，擴(kuò)大分離對(duì)象。

9、溫度：

電泳過程中，由于通電會(huì)產(chǎn)生焦耳熱，焦耳熱對(duì)電泳影響很大。溫度每變化1℃，將引起背景電解質(zhì)溶液的粘度變化2%～3%，遷移率增加約2.4%。為了降低熱效應(yīng)對(duì)電泳的影響，可控制電壓、電流和在電泳系統(tǒng)中安裝冷卻散熱裝置。

10、電滲流：

（1）改變電滲流大小和方向可改變分離效率和選擇性。

（2）電滲流的微小變化會(huì)影響分離結(jié)果的重現(xiàn)性。

   

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